荧光原位杂交的实验步骤有哪些

荧光原位杂交的实验步骤有哪些

仪器设备

1、 医用微波炉;

2、 水浴锅;

3、荧光显微镜;

4、数字显微照相机。

FISH试剂

(1)1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃;

(2)20×SSC(pH7.0);

(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;

(4)25mg/ml蛋白酶K消化液。

(5)变性液(70%甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC;8ml蒸馏水;28ml甲酰胺。每次新鲜配制。

(6)杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。(7)封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

(8)封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

(9)荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

实验步骤

1、脱蜡：

1)二甲苯脱蜡3次，每次5min;

2)100%酒精两次，每次2min;

3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:

1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。

3) ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。

3、变性：

1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;

2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;

3)78℃孵育8min;

4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min;

5)空气干燥。

4、杂交：

1)准备探针;

2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片;

3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片;

4)盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：

5)镊子小心去除盖玻片;

6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;

7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min;

8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

检测：

9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

10)每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min;

11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。

12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;

13)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min;

14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min;

15)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;

16)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min;

17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：

1)张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml;

2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

6. 荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

唐氏综合症的检查诊断

唐氏综合症检查包括对外周血细胞染色体核型分析、羊水 细胞染色体检查、荧光原位杂交、产前筛查血清标志物、X线片、超声、心电图、脑电图等检查。另外唐氏综合症与先天性甲状腺功能减低症鉴别。

1、对外周血细胞染色体核型分析：细胞遗传学研究发现，21q22区可能是唐氏综合征的基因关键区带，又称为唐氏综合征区。

2、羊水细胞染色体检查：羊水细胞染色体检查是唐氏综合征产前诊断的一种有效方法，唐氏筛查结果为“高危”的孕妇需要确诊胎儿是否为唐氏综合症患儿。目前产前诊断最常用的技术是羊膜腔穿刺技术，即在B超指引下，将针通过孕妇腹部刺入羊水中，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析。适宜孕16-20周的孕妇。除羊膜腔穿刺术外，进行产前诊断的技术还有绒毛活检、胎儿脐静脉穿刺、胎儿镜检查等。

3、荧光原位杂交：以21号染色体的相应部位序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行杂交，唐氏综合征患者的细胞中可呈现3个21号染色体的荧光信号。

4、产前筛查血清标志物：采用测定孕妇血清绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(FE3)进行唐氏综合征筛查的探索已有多年，这是一种怀孕中期指标(13周以后)，根据这3项(也可测定HCG和AFP两项)血清学指标以及孕妇年龄、体重来推算怀有唐氏综合征患儿的风险率，根据风险率的高低再进一步进行确诊检查。采用这一方法可以检出大约60%的唐氏综合征胎儿。

5、可常规做X线片、超声、心电图、脑电图等检查：部分患儿可发现先天性心脏病，骨龄落后，脑电图异常等改变。

染色体异常的检查方法

1、Down综合征血清学检查可见血清素降低，白细胞中碱性磷酸酶增高，红细胞二磷酸葡萄糖增高，过氧化物歧化酶增高50%，但与患者发育异常及智力低下无关。

2、约1/3的Down综合征患儿母亲在妊娠4～6个月时血清甲胎蛋白含量增高，血清绒毛膜促性腺激素含量增高，雌三醇含量降低，可提示胎儿Down综合征，检查结果阳性孕妇应行羊膜囊穿刺，检测患者羊水细胞或染色体。

3、孕妇行羊膜囊穿刺可发现羊水细胞染色体异常，可以早期筛查Down综合征患儿及其他染色体发育不全。

4、染色体检查可用荧光原位杂交技术检测患者羊水细胞或染色体，如Down综合征可发现21号染色体为三倍体。

唐氏综合症的检查诊断

1、对外周血细胞染色体核型分析：细胞遗传学研究发现，21q22区可能是唐氏综合征的基因关键区带，又称为唐氏综合征区。

2、羊水细胞染色体检查：羊水细胞染色体检查是唐氏综合征产前诊断的一种有效方法，唐氏筛查结果为“高危”的孕妇需要确诊胎儿是否为唐氏综合症患儿。目前产前诊断最常用的技术是羊膜腔穿刺技术，即在B超指引下，将针通过孕妇腹部刺入羊水中，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析。适宜孕16-20周的孕妇。除羊膜腔穿刺术外，进行产前诊断的技术还有绒毛活检、胎儿脐静脉穿刺、胎儿镜检查等。

3、荧光原位杂交：以21号染色体的相应部位序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行杂交，唐氏综合征患者的细胞中可呈现3个21号染色体的荧光信号。

4、产前筛查血清标志物：采用测定孕妇血清绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(FE3)进行唐氏综合征筛查的探索已有多年，这是一种怀孕中期指标(13周以后)，根据这3项(也可测定HCG和AFP两项)血清学指标以及孕妇年龄、体重来推算怀有唐氏综合征患儿的风险率，根据风险率的高低再进一步进行确诊检查。采用这一方法可以检出大约60%的唐氏综合征胎儿。

5、可常规做X线片、超声、心电图、脑电图等检查：部分患儿可发现先天性心脏病，骨龄落后，脑电图异常等改变。

荧光原位杂交的临床应用有哪些

1、临床细胞遗传学：有助于进一步证实染色体带型，用于确定标记染色体的起源。对于染色体亚显微缺失的检测很敏感，由于诊断显微缺失综合征。

2、产前诊断：染色体异常的产前诊断主要依靠细胞分裂中期染色体的分析，但这一常规细胞遗传学方法需要两至三周完成。而应用生物素标记的染色体特异性探针对未经培养的绒毛细胞或羊水细胞进行原位交杂即可快速诊断常见的三体型及性染色体数目畸变。使用这一方法进行染色体数目异常的产前诊断只需要一天的时间，可以省去复杂的细胞培养及染色体分析过程。另外，FISHA在染色体结构异常的产前诊断中，不仅对那些易位性重排，而且对重复，缺失或者插入性重排都能为确定类型，来源和断裂点提供可靠依据。对标记染色体，环状染色体来源的研究中，FISH也具有高度的敏感性和可靠性。

3、肿瘤诊断：肿瘤细胞的染色体常常发生易位、缺失、倒位与扩增等改变，而肿瘤细胞的分裂指数较低而且分裂相显带困难，经常很难分析。染色体荧光原位杂交技术的应用，使大部分上述改变的阐明大为简化。

4、传染性疾病的诊断：诊断病原体的程序已有报告。

21三体综合症风险值怎么看

现代医学证实，唐氏综合征发生率与母亲怀孕年龄有相关，系21号染色体的异常，有三体、易位及嵌合三种类型。高龄孕妇、卵子老化是发生不分离的重要原因。

检查：

1.羊水细胞染色体检查

羊水细胞染色体检查是唐氏综合征产前诊断的一种有效方法，唐氏筛查结果为“高危”的孕妇需要确诊胎儿是否为唐氏综合征患儿。目前产前诊断最常用的技术是羊膜腔穿刺技术，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析。适宜孕16～20周的孕妇。除羊膜腔穿刺术外，进行产前诊断的技术还有绒毛活检、胎儿脐静脉穿刺、胎儿镜检查等。

2.荧光原位杂交

以21号染色体的相应部位序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行杂交，唐氏综合征患者的细胞中可呈现3个21号染色体的荧光信号。若选择唐氏综合征核心区的特异序列作为探针，进行FISH杂交分析。

3.产前筛查血清标志物

采用测定孕妇血清绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(FE3)进行唐氏综合征筛查的探索已有多年，这是一种怀孕中期指标(13周以后)。

根据这3项(也可测定HCG和AFP两项)血清学指标以及孕妇年龄、体重来推算怀有唐氏综合征患儿的风险率，根据风险率的高低再进一步进行确诊检查。

胎儿在母亲的体内的时候能够健康的成长，除了与父母的遗传基因有关系之外，还和母亲在怀孕期间受到病原体的感染有关系。尤其是风疹病毒，对胎儿的威胁非常大。造成畸形的概率很高的哦。

食道乳头状瘤症状有什么

食道癌又叫食管癌，是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。全世界每年约有22万人死于食道癌，我国是食道癌高发区，因食道癌死亡者仅次于胃癌居第二位，发病年龄多在40岁以上，男性多于女性。

一项最新研究发现，人乳头状瘤病毒(hpv)感染是食管癌的重要发病因素。hpv是一种亲上皮细胞的双链dna病毒。

以往研究发现，hpv在世界范围内与15%的人类肿瘤相关。食管癌是一种常见的恶性肿瘤，自20世纪80年代以来，国内外专家就在研究hpv与食管癌的关系，但至今仍无定论。

我国河南安阳地区是食管癌高发区，为探讨人乳头状瘤病毒感染与该地区食管癌发病的关系，专家首次用安阳食管癌高发区现场“正常”人群食管拉网的样品进行测定，方法为聚合酶链式反应(pcr)和原位杂交(ish)。

其中高发区138例，低发区68例。结果高发村与低发村相比，hpv16型阳性率不同(72%和37%);pcr测定的hpvdna在细胞中的存在，及ish测定的病毒癌基因的表达与食管上皮细胞的癌变进程相关，随癌变的增加阳性率上升。

针对病毒的不同部位开展pcr检测，结果发现以往所用的l1区(病毒外壳蛋白编码区)检出率大大低于e6和e7区(病毒早期蛋白即病毒致癌基因编码区)，这一结果解释了以前报道不一致性的可能原因是pcr测定位点不同所致。

用fish(染色体荧光原位杂交)方法证明了病毒在感染细胞核中的早期整合。研究结果表明：hpv16型是安阳地区食管癌的重要病因因素。

据专家介绍，以往对hpv与食管癌关系的研究存在争议，原因主要是方法使用不一致或不当;另外是观念上的问题——将传染病的模式用于癌变研究，但实际上凡致癌的生物因素(如病毒)均不会引起急性传染性疾病的发生，而是长期慢性过程，同时需要机体的遗传易感因素的存在。

遗传病携带者也能生健康宝宝

由于大多数遗传病不可治疗，因此预防有遗传病患儿的出生尤为重要。辅助生殖技术的发展尤其是胚胎植入前遗传学诊断试管婴儿(PGD)的发展不仅能够预防遗传病患儿的出生，同时还可以帮助遗传病携带者生健康宝宝。PGD是在胚胎种植到子宫内膜之前对其进行检查，选择正常的胚胎进行移植。它是一种更早形式的产前诊断，因此它克服了因产前诊断胎儿异常后治疗性流产带来的生理和心理的痛苦。

自从1990年Handyside等报道第一例胚胎植入前遗传学诊断试管婴儿成功以来，已经完成了超过4000个周期。用于检测人类胚胎中100多种不同的遗传病。PGD主要步骤有控制性超排卵、取卵、受精、胚胎活检、遗传学检测、正常胚胎移植等。目前主要用于检测的是卵裂期胚胎的卵裂球和囊胚的滋养外胚层细胞。常用的遗传学检测方法主要有荧光原位杂交方法(FISH)和聚合酶链反应(PCR)。近年来有新的检测方法用于PGD如比较基因组杂交(CGH)、基因芯片(Microarray)等，新方法的应用大大提高了诊断的准确率，降低了误诊率，使PGD在提高试管婴儿成功率，预防出生缺陷患儿出生，帮助遗传病携带者生健康宝宝的作用进一步凸现。

总之，虽然胚胎植入前遗传学诊断试管婴儿技术仍然存在可圈可点的地方，但它在辅助生殖中的临床意义毋庸置疑。随着新技术的不断进步，PGD在预防出生缺陷、提高人口素质等方面将发挥更大的作用。

注射用曲妥珠单抗药理作用

曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。此抗体属IgGl型，含人的框架区，及能与HER-2结合的鼠抗-p185 HER2抗体的互补决定区。 人源化的抗HER2抗体是由悬养于无菌培养基中的哺乳动物细胞(中CHO)产生的，用亲合色谱法和离子交换法纯化，包括特殊的病毒灭活的去除程序。国仓鼠卵巢细胞

HER2原癌基因或C-erbB2编码一个单一的受体样跨膜蛋白，分子量185kDa，其结构上与表皮生长因子受体相关。在原发性乳腺癌患者中观察到有25%-30%的患者HER2过度表达。HER2基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面HER2蛋白表达增加，导致 HER2受体活化。

研究表明，HER2过度表达的肿瘤患者较无过度表达的无病生存期短。HER2的过度表达可通过以下方法诊断：对肿瘤组织块以免疫组化为基础的评价法，组织或血浆样品的ELISA法或荧光原位杂交法(FISH)。 曲妥珠单抗在体外及动物实验中均显示可抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。另外，曲妥珠单抗是抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应(ADCC)的潜在介质。在体外研究中，曲妥珠单抗介导的ADCC被证明在HER2过度表达的癌细胞中比HER2非过度表达的癌细胞中更优先产生。

染色体异常的检查项目有哪些

1.Down综合征血清学检查可见血清素降低，白细胞中碱性磷酸酶增高，红细胞二磷酸葡萄糖增高，过氧化物歧化酶增高50%，但与患者发育异常及智力低下无关。

2.约1/3的Down综合征患儿母亲在妊娠4～6个月时血清甲胎蛋白含量增高，血清绒毛膜促性腺激素含量增高、雌三醇含量降低，可提示胎儿Down综合征。检查结果阳性孕妇应行羊膜囊穿刺，检测患者羊水细胞或染色体。

孕妇行羊膜囊穿刺可发现羊水细胞染色体异常，可以早期筛查Down综合征患儿及其他染色体发育不全。

染色体检查可用荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization technique)检测患者羊水细胞或染色体，如Down综合征可发现21号染色体为三倍体。

什么是染色体核型分析

染色体核型分析是一种技术，传统上是观察染色体形态，近年来，采用荧光原位杂交技术，将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记，可以精确地检测染色体上DNA链中，单个碱基的突变，从而大大提高了染色体核型分析的精度。

不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。而采用荧光原位杂交技术，将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记的染色体核型分析，则可通过荧光检测仪器，直接判读反应体系荧光信号的变化强度，直接测定染色体DNA链中单个碱基的突变。

染色体异常的实验室检查

1、Down综合征血清学检查可见血清素降低、白细胞中碱性、磷酸酶增高、红细胞二磷酸葡萄糖增高、过氧化物歧化酶增高50%、但与患者发育异常及智力低下无关。

2、约1/3的Down综合征患儿母亲在妊娠4～6个月时血清甲胎蛋白含量增高，血清绒毛膜促性腺激素含量增

产前检查是关键，高、雌三醇含量降低，可提示胎儿Down综合征检查结果。阳性孕妇应行羊膜囊穿刺，检测患者羊水细胞或染色体。

其它染色体异常的辅助检查：

孕妇行羊膜囊穿刺，可发现羊水细胞染色体异常，可以早期筛查Down综合征患儿及其他染色体异常。

染色体检查，可用荧光原位杂交技术检测患者羊水细胞或染色体，如Down综合征可发现21号染色体为三倍体。

荧光原位杂交的特点是什么

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是 FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。

优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH 通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

染色体异常的实验室检查

在人类大多数细胞核中都有染色体，在细胞分裂时呈现46条杆状结构。染色体由dna和蛋白质组成，大多数基因均位于染色体的dna之中。如果染色体出现异常表现形式，相应的患者就会出现一些对应的机体或智力缺失，本文将为您介绍染色体异常的检查方法。

染色体异常的实验室检查：

1、Down综合征血清学检查可见血清素降低、白细胞中碱性、磷酸酶增高、红细胞二磷酸葡萄糖增高、过氧化物歧化酶增高50%、但与患者发育异常及智力低下无关。

2、约1/3的Down综合征患儿母亲在妊娠4～6个月时血清甲胎蛋白含量增高，血清绒毛膜促性腺激素含量增

产前检查是关键，高、雌三醇含量降低，可提示胎儿Down综合征检查结果。阳性孕妇应行羊膜囊穿刺，检测患者羊水细胞或染色体。

其它染色体异常的辅助检查：

孕妇行羊膜囊穿刺，可发现羊水细胞染色体异常，可以早期筛查Down综合征患儿及其他染色体异常。

染色体检查，可用荧光原位杂交技术检测患者羊水细胞或染色体，如Down综合征可发现21号染色体为三倍体。